какую функцию в клетке выполняет белок днк полимераза

ДНК и гены

ДНК ПРОКАРИОТ И ЭУКАРИОТ

Справа крупнейшая спираль ДНК человека, выстроенная из людей на пляже в Варне (Болгария), вошедшая в книгу рекордов Гиннесса 23 апреля 2016 года

Дезоксирибонуклеиновая кислота. Общие сведения

Дезоксирибонуклеи́новая кислота (ДНК) — макромолекула (одна из трёх основных, две другие — РНК и белки), обеспечивающая хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. ДНК содержит информацию о структуре различных видов РНК и белков.

В клетках эукариот (животных, растений и грибов) ДНК находится в ядре клетки в составе хромосом, а также в некоторых клеточных органоидах (митохондриях и пластидах). В клетках прокариотических организмов (бактерий и архей) кольцевая или линейная молекула ДНК, так называемый нуклеоид, прикреплена изнутри к клеточной мембране. У них и у низших эукариот (например, дрожжей) встречаются также небольшие автономные, преимущественно кольцевые молекулы ДНК, называемые плазмидами.

С химической точки зрения ДНК — это длинная полимерная молекула, состоящая из повторяющихся блоков — нуклеотидов. Каждый нуклеотид состоит из азотистого основания, сахара (дезоксирибозы) и фосфатной группы. Связи между нуклеотидами в цепи образуются за счёт дезоксирибозы (С) и фосфатной (Ф) группы (фосфодиэфирные связи).

Рис. 2. Нуклертид состоит из азотистого основания, сахара (дезоксирибозы) и фосфатной группы

В подавляющем большинстве случаев (кроме некоторых вирусов, содержащих одноцепочечную ДНК) макромолекула ДНК состоит из двух цепей, ориентированных азотистыми основаниями друг к другу. Эта двухцепочечная молекула закручена по винтовой линии.

В ДНК встречается четыре вида азотистых оснований (аденин, гуанин, тимин и цитозин). Азотистые основания одной из цепей соединены с азотистыми основаниями другой цепи водородными связями согласно принципу комплементарности: аденин соединяется только с тимином (А-Т), гуанин — только с цитозином (Г-Ц). Именно эти пары и составляют «перекладины» винтовой «лестницы» ДНК (см.: рис. 2, 3 и 4).

Рис. 2. Азотистые основания

Последовательность нуклеотидов позволяет «кодировать» информацию о различных типах РНК, наиболее важными из которых являются информационные, или матричные (мРНК), рибосомальные (рРНК) и транспортные (тРНК). Все эти типы РНК синтезируются на матрице ДНК за счёт копирования последовательности ДНК в последовательность РНК, синтезируемой в процессе транскрипции, и принимают участие в биосинтезе белков (процессе трансляции). Помимо кодирующих последовательностей, ДНК клеток содержит последовательности, выполняющие регуляторные и структурные функции.

Рис. 3. Репликация ДНК

Расположение базовых комбинаций химических соединений ДНК и количественные соотношения между этими комбинациями обеспечивают кодирование наследственной информации.

Образование новой ДНК (репликация)

По завершении дупликации образуются две самостоятельные спирали, созданные из химических соединений родительской ДНК и имеющие с ней одинаковый генетический код. Таким путем ДНК способна перерывать информацию от клетки к клетке.

Более подробная информация:

СТРОЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) относится к нуклеиновым кислотам. Нуклеиновые кислоты – это класс нерегулярных биополимеров, мономерами которых являются нуклеотиды.

НУКЛЕОТИДЫ состоят из азотистого основания, соединенного с пятиуглеродным углеводом (пентозой) – дезоксирибозой (в случае ДНК) или рибозой (в случае РНК), который соединяется с остатком фосфорной кислоты (H₂PO₃–).

Азотистые основания бывают двух типов: пиримидиновые основания – урацил (только в РНК), цитозин и тимин, пуриновые основания – аденин и гуанин.

Рис. 5. Структура нуклеотидов (слева), расположение нуклеотида в ДНК (снизу) и типы азотистых оснований (справа): пиримидиновые и пуриновые

Атомы углерода в молекуле пентозы нумеруются числами от 1 до 5. Фосфат соединяется с третьим и пятым атомами углерода. Так нуклеинотиды соединяются в цепь нуклеиновой кислоты. Таким образом, мы можем выделить 3’ и 5’-концы цепи ДНК:

Рис. 6. Выделение 3’ и 5’-концов цепи ДНК

Две цепи ДНК образуют двойную спираль. Эти цепи в спирали сориентированы в противоположных направлениях. В разных цепях ДНК азотистые основания соединены между собой с помощью водородных связей. Аденин всегда соединяется с тимином, а цитозин – с гуанином. Это называется правилом комплементарности (см. принцип комплементарности ).

Правило комплементарности:

Например, если нам дана цепь ДНК, имеющая последовательность

3’– ATGTCCTAGCTGCTCG – 5’,

то вторая ей цепь будет комплементарна и направлена в противоположном направлении – от 5’-конца к 3’-концу:

5’– TACAGGATCGACGAGC– 3’.

Рис. 7. Направленность цепей молекулы ДНК и соединение азотистых оснований с помощью водородных связей

РЕПЛИКАЦИЯ ДНК

Репликация ДНК – это процесс удвоения молекулы ДНК путем матричного синтеза. В большинстве случаев естественной репликации ДНК праймером для синтеза ДНК является короткий фрагмент РНК (создаваемый заново). Такой рибонуклеотидный праймер создается ферментом праймазой (ДНК-праймаза у прокариот, ДНК-полимераза у эукариот), и впоследствии заменяется дезоксирибонуклеотидами полимеразой, выполняющей в норме функции репарации (исправления химических повреждений и разрывов в молекле ДНК).

Репликация происходит по полуконсервативному механизму. Это значит, что двойная спираль ДНК расплетается и на каждой из ее цепей по принципу комплементарности достраивается новая цепь. Дочерняя молекула ДНК, таким образом, содержит в себе одну цепь от материнской молекулы и одну вновь синтезированную. Репликация происходит в направлении от 3’ к 5’ концу материнской цепи.

Рис. 8. Репликация (удвоение) молекулы ДНК

ДНК-синтез – это не такой сложный процесс, как может показаться на первый взгляд. Если подумать, то для начала нужно разобраться, что же такое синтез. Это процесс объединения чего-либо в одно целое. Образование новой молекулы ДНК проходит в несколько этапов:

Рис. 9. Схематическое изображение процесса репликации ДНК: (1) Отстающая цепь (запаздывающая нить), (2) Ведущая цепь (лидирующая нить), (3) ДНК-полимераза α ( Polα ), (4) ДНК-лигаза, (5) РНК-праймер, (6) Праймаза, (7) Фрагмент Оказаки, (8) ДНК-полимераза δ ( Polδ ), (9) Хеликаза, (10) Однонитевые ДНК-связывающие белки, (11) Топоизомераза.

Далее описан синтез отстающей цепи дочерней ДНК (см. Схему репликативной вилки и функции ферментов репликации)

Нагляднее о репликации ДНК см. видео →

5) Непосредственно сразу после расплетания и стабилизации другой нити материнской молекулы к ней присоединяется ДНК-полимераза α (альфа) и в направлении 5’→3′ синтезирует праймер (РНК-затравку) – последовательность РНК на матрице ДНК длиной от 10 до 200 нуклеотидов. После этого фермент удаляется с нити ДНК.

СТРОЕНИЕ РНК

Рибонуклеиновая кислота (РНК) — одна из трёх основных макромолекул (две другие — ДНК и белки), которые содержатся в клетках всех живых организмов.

Последовательность нуклеотидов позволяет РНК кодировать генетическую информацию. Все клеточные организмы используют РНК (мРНК) для программирования синтеза белков.

Затем матричные РНК (мРНК) принимают участие в процессе, называемом трансляцией, т.е. синтеза белка на матрице мРНК при участии рибосом. Другие РНК после транскрипции подвергаются химическим модификациям, и после образования вторичной и третичной структур выполняют функции, зависящие от типа РНК.

Рис. 10. Отличие ДНК от РНК по азотистому основанию: вместо тимина (Т) в РНК представлен урацил (U), который также комплементарен аденину.

ТРАНСКРИПЦИЯ

Транскрипция – это процесс синтеза РНК на матрице ДНК. ДНК раскручивается на одном из участков. На одной из цепей содержится информация, которую необходимо скопировать на молекулу РНК – эта цепь называется кодирующей. Вторая цепь ДНК, комплементарная кодирующей, называется матричной. В процессе транскрипции на матричной цепи в направлении 3’ – 5’ (по цепи ДНК) синтезируется комплементарная ей цепь РНК. Таким образом, создается РНК-копия кодирующей цепи.

Рис. 11. Схематическое изображение транскрипции

Например, если нам дана последовательность кодирующей цепи

3’– ATGTCCTAGCTGCTCG – 5’,

то, по правилу комплементарности, матричная цепь будет нести последовательность

5’– TACAGGATCGACGAGC– 3’,

а синтезируемая с нее РНК – последовательность

3’– AUGUCCUAGCUGCUCG – 5’.

ТРАНСЛЯЦИЯ

Рассмотрим механизм синтеза белка на матрице РНК, а также генетический код и его свойства. Также для наглядности по ниже приведенной ссылке рекомендуем посмотреть небольшое видео о процессах транскрипции и трансляции, происходящих в живой клетке:

Рис. 12. Процесс синтеза белка: ДНК кодирует РНК, РНК кодирует белок

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД

Генетический код, общий для большинства про- и эукариот. В таблице приведены все 64 кодона и указаны соответствующие аминокислоты. Порядок оснований — от 5′ к 3′ концу мРНК.

Таблица 1. Стандартный генетический код

Среди триплетов есть 4 специальных последовательности, выполняющих функции «знаков препинания»:

Свойства генетического кода

1. Триплетность. Каждая аминокислота кодируется последовательностью из трех нуклеотидов – триплетом или кодоном.

2. Непрерывность. Между триплетами нет никаких дополнительных нуклеотидов, информация считывается непрерывно.

3. Неперекрываемость. Один нуклеотид не может входить одновременно в два триплета.

4. Однозначность. Один кодон может кодировать только одну аминокислоту.

5. Вырожденность. Одна аминокислота может кодироваться несколькими разными кодонами.

6. Универсальность. Генетический код одинаков для всех живых организмов.

Пример. Нам дана последовательность кодирующей цепи:

3’– CCGATTGCACGTCGATCGTATA– 5’.

Матричная цепь будет иметь последовательность:

5’– GGCTAACGTGCAGCTAGCATAT– 3’.

Теперь «синтезируем» с этой цепи информационную РНК:

3’– CCGAUUGCACGUCGAUCGUAUA– 5’.

Синтез белка идет в направлении 5’ → 3’, следовательно, нам нужно перевернуть последовательность, чтобы «прочитать» генетический код:

5’– AUAUGCUAGCUGCACGUUAGCC– 3’.

Теперь найдем старт-кодон AUG:

5’– AU AUG CUAGCUGCACGUUAGCC– 3’.

Разделим последовательность на триплеты:

Найдем стоп-кодон и согласно таблице генетического кода запишем последовательность аминокислот:

Центральная догма молекулярной биологии звучит следующим образом: информация с ДНК передается на РНК (транскрипция), с РНК – на белок (трансляция). ДНК также может удваиваться путем репликации, и также возможен процесс обратной транскрипции, когда по матрице РНК синтезируется ДНК, но такой процесс в основном характерен для вирусов.

Рис. 13. Центральная догма молекулярной биологии

ГЕНОМ: ГЕНЫ и ХРОМОСОМЫ

Термин «геном» был предложен Г. Винклером в 1920 г. для описания совокупности генов, заключенных в гаплоидном наборе хромосом организмов одного биологического вида. Первоначальный смысл этого термина указывал на то, что понятие генома в отличие от генотипа является генетической характеристикой вида в целом, а не отдельной особи. С развитием молекулярной генетики значение данного термина изменилось. Известно, что ДНК, которая является носителем генетической информации у большинства организмов и, следовательно, составляет основу генома, включает в себя не только гены в современном смысле этого слова. Большая часть ДНК эукариотических клеток представлена некодирующими («избыточными») последовательностями нуклеотидов, которые не заключают в себе информации о белках и нуклеиновых кислотах. Таким образом, основную часть генома любого организма составляет вся ДНК его гаплоидного набора хромосом.

Гены — это участки молекул ДНК, кодирующие полипептиды и молекулы РНК

За последнее столетие наше представление о генах существенно изменилось. Ранее геном называли участок хромосомы, кодирующий или определяющий один признак или фенотипическое (видимое) свойство, например цвет глаз.

В 1940 г. Джордж Бидл и Эдвард Тейтем предложили молекулярное определение гена. Ученые обрабатывали споры гриба Neurospora crassa рентгеновским излучением и другими агентами, вызывающими изменения в последовательности ДНК (мутации), и обнаружили мутантные штаммы гриба, утратившие некоторые специфические ферменты, что в некоторых случаях приводило к нарушению целого метаболического пути. Бидл и Тейтем пришли к выводу, что ген — это участок генетического материала, который определяет или кодирует один фермент. Так появилась гипотеза «один ген — один фермент». Позднее эта концепция была расширена до определения «один ген — один полипептид», поскольку многие гены кодируют белки, не являющиеся ферментами, а полипептид может оказаться субъединицей сложного белкового комплекса.

Современное биохимическое определение гена еще более конкретно. Генами называются все участки ДНК, кодирующие первичную последовательность конечных продуктов, к которым относятся полипептиды или РНК, обладающие структурной или каталитической функцией.

Наряду с генами ДНК содержит и другие последовательности, выполняющие исключительно регуляторную функцию. Регуляторные последовательности могут обозначать начало или конец генов, влиять на транскрипцию или указывать место инициации репликации или рекомбинации. Некоторые гены могут экспрессироваться разными путями, при этом один и тот же участок ДНК служит матрицей для образования разных продуктов.

Мы можем приблизительно рассчитать минимальный размер гена, кодирующего средний белок. Каждая аминокислота в полипептидной цепи кодируется последовательностью из трех нуклеотидов; последовательности этих триплетов (кодонов) соответствуют цепочке аминокислот в полипептиде, который кодируется данным геном. Полипептидная цепь из 350 аминокислотных остатков (цепь средней длины) соответствует последовательности из 1050 п.н. (пар нуклеотидов). Однако многие гены эукариот и некоторые гены прокариот прерываются сегментами ДНК, не несущими информации о белке, и поэтому оказываются значительно длиннее, чем показывает простой расчет.

Сколько генов в одной хромосоме?

ДНК прокариот устроена более просто: их клетки не имеют ядра, поэтому ДНК находится непосредственно в цитоплазме в форме нуклеоида.

Как известно, бактериальные клетки имеют хромосому в виде нити ДНК, уложенной в компактную структуру – нуклеоид. Хромосома прокариота Escherichia coli, чей геном полностью расшифрован, представляет собой кольцевую молекулу ДНК (на самом деле, это не правильный круг, а скорее петля без начала и конца), состоящую из 4 639 675 п.н. В этой последовательности содержится примерно 4300 генов белков и еще 157 генов стабильных молекул РНК. В геноме человека примерно 3,1 млрд пар нуклеотидов, соответствующих почти 29 000 генам, расположенным на 24 разных хромосомах.

Прокариоты (Бактерии).

Бактерия E. coli имеет одну двухцепочечную кольцевую молекулу ДНК. Она состоит из 4 639 675 п.н. и достигает в длину примерно 1,7 мм, что превышает длину самой клетки E. coli приблизительно в 850 раз. Помимо крупной кольцевой хромосомы в составе нуклеоида многие бактерии содержат одну или несколько маленьких кольцевых молекул ДНК, свободно располагающихся в цитозоле. Такие внехромосомные элементы называют плазмидами (рис. 16).

Большинство плазмид состоит всего из нескольких тысяч пар нуклеотидов, некоторые содержат более 10000 п. н. Они несут генетическую информацию и реплицируются с образованием дочерних плазмид, которые попадают в дочерние клетки в процессе деления родительской клетки. Плазмиды обнаружены не только в бактериях, но также в дрожжах и других грибах. Во многих случаях плазмиды не дают никаких преимуществ клеткам-хозяевам, и их единственная задача — независимое воспроизведение. Однако некоторые плазмиды несут полезные для хозяина гены. Например, содержащиеся в плазмидах гены могут придавать клеткам бактерий устойчивость к антибактериальным агентам. Плазмиды, несущие ген β-лактамазы, обеспечивают устойчивость к β-лактамным антибиотикам, таким как пенициллин и амоксициллин. Плазмиды могут переходить от клеток, устойчивых к антибиотикам, к другим клеткам того же или другого вида бактерий, в результате чего эти клетки также становятся резистентными. Интенсивное применение антибиотиков является мощным селективным фактором, способствующим распространению плазмид, кодирующих устойчивость к антибиотикам (а также транспозонов, которые кодируют аналогичные гены) среди болезнетворных бактерий, и приводит к появлению бактериальных штаммов с устойчивостью к нескольким антибиотикам. Врачи начинают понимать опасность широкого использования антибиотиков и назначают их только в случае острой необходимости. По аналогичным причинам ограничивается широкое использование антибиотиков для лечения сельскохозяйственных животных.

Эукариоты.

Таблица 2. ДНК, гены и хромосомы некоторых организмов

Источник

ДНК-полимераза как регулятор иммунитета. История одного открытия из первых рук

Зеленый шарик — это хорошо!

Автор

Редакторы

Недавно мне повезло участвовать в международном исследовании, результаты которого попали на страницы Nature Immunology. Мы смогли открыть новую мутацию, приводящую к очень редкому иммунологическому синдрому; мы умудрились разобраться в молекулярной основе этого синдрома, а также открыли новый тип биологических молекул, регулирующих внутриклеточный иммунитет. Это был незабываемый опыт, которым я хочу поделиться по свежей памяти с широкой аудиторией.

Предыстория

В далеком 2006 году, в Киеве, я торжественно вставил в рамку диплом кандидата биологических наук и стал думать, как жить дальше. Вариантов на тот момент было немного — мне очень хотелось заняться иммунологией, а эта область науки требует дорогостоящего оборудования и квалифицированных коллег. Поэтому на тот момент найти хорошую лабораторию я смог только за рубежом. Кстати, в то же время я присоединился к недавно созданному молодому сайту — Биомолекула.ру (если не ошибаюсь, моя учетная запись идет под номером 35).

Итак, я получил приглашение поработать пост-доком в Вайцманновском институте (Израиль), и всё завертелось. Мне повезло: в Израиле я попал в именитую лабораторию и смог освоить самые современные методы, постепенно получив неплохую специализацию в области молекулярной иммунологии клетки. И после трех лет в земле обетованной я попал в США, где получил второй пост-док в одно из отделений Техасского университета (UT Southwestern Medical Center). Мне опять повезло: университет занимается медицинскими исследованиями, в то же время являясь действующей больницей. Это позволило постепенно объединить мои иммунологические исследования с проблемами конкретных пациентов. И хотя я сам не медик и не имею допуска к пациентам, я работаю в составе большой команды специалистов, включающей медиков, генетиков, биоинформатиков и др. Мои обязанности — исследовать молекулярными методами материалы, полученные от пациентов: как правило, это клетки крови или культуры фибробластов кожи. Ниже описан один из таких проектов, который неожиданно для всех нас перерос в нечто гораздо большее.

XLPDR — синдром, про который ничего неизвестно

Как-то раз к нам за консультацией обратились генетики. Они уже давно бились над идентификацией гена, вызывающего очень редкий синдром, названия которому даже нет по-русски, — X-linked reticulate pigmentary disorder (XLPDR). На сегодня известно только около десятка семей во всем мире, в которых отмечены случаи этого заболевания. Болеют только мальчики (болезнь классически сцеплена с Х-хромосомой), ну а девочки являются носителями без каких-либо особо заметных проявлений болезни. Синдром характеризируется пятнистой (похоже на яркие веснушки) и сухой кожей по всему телу (у большинства пациентов хронический ангидроз — с рождения нет потовых желез) и очень специфическим лицом с направленными назад волосами (рис. 1). Однако самое неприятное — помимо фенотипических признаков, у этих пациентов постоянные воспалительные процессы в легких, почках и желудочно-кишечном тракте. Ничего о природе и механизмах этой редкой болезни на момент начала работы не было известно.

Рисунок 1. Пациенты с синдромом XLPDR.

. Итак, генетики обратились к нам с просьбой изучить молекулярный механизм синдрома XLPDR. Традиционный быстрый сиквенс генома (сиквенс последовательностей только экзонов, exome sequencing) результатов не приносил, и найти мутацию относительно дешевыми методами генетикам не удавалось. Поэтому нас попросили взглянуть на проблему c точки зрения молекулярной иммунологии — мы как раз тогда только-только опубликовали похожего типа статью, где описали молекулярные изменения во внутриклеточных сигнальных путях у больных с другим редким синдромом — XLID (наследственное слабоумие, тоже сцепленное с Х-хромосомой и тоже проявляющееся только у мальчиков) [1]. То есть мы к тому времени уже имели опыт иммунологических исследований реальных больных «с нуля». Кроме того, как раз двое больных с XLPDR наблюдались в нашей больнице. В общем, мы охотно ввязались в новый проект.

Надежда на быстрый успех

Поначалу дело спорилось: все клеточные линии, полученные от пациентов (фибробласты кожи и клетки крови), показывали на порядки более высокую экспрессию всей палитры иммунологических маркеров-генов. И NF-kB, и интерферон-зависимые гены экспрессировались через край без видимой на то причины. Было похоже, что у больных утратил свои функции некий важный ген-регулятор, и клеткам постоянно чудилось вторжение коварных вирусов, даже когда они росли в стерильных условиях инкубатора. Задокументировав все артефакты, мы стали дожидаться, когда генетики выяснят имя гена, который бы содержал мутацию у всех больных.

О нормальной — то есть довольно халатной — работе этого фермента и механизмах закрепления его ошибок в геноме очень доходчиво рассказывает статья «Следы полимеразы α» [2]. — Ред.

Рисунок 2. Схема гена POLA1 и мРНК у здоровых людей (а) и у больных XLPDR (б). В результате точечной замены в интроне 13 (звездочка) образуется ложный альтернативный сайт сплайсинга, и бόльшая часть пре-мРНК образует нежизнеспособную мРНК, которая быстро деградирует. Меньшая часть мРНК всё же собирается правильно, что обеспечивает выживание клеток (репликацию), однако этого количества POLA1 не хватает для выполнения альтернативных функций (см. дальше).

Первая загадка

Первая гипотеза — что больные болеют из-за неспособности лимфоцитов при инфекции быстро размножаться и подавлять инфекцию — была опровергнута простым анализом крови. Мы обнаружили, что мутация не влияет на количество иммунных клеток в крови больных, и значит, делятся они нормально. Стало быть, нарушение метаболизма происходит внутри самих клеток, и это каким-то неведомым образом провоцирует иммунный ответ.

И правда — исследовав клетки пациентов, мы нашли, что дефицит полимеразы почему-то приводит к хронической активации многих сигнальных путей. Кроме того, если с помощью специфической киРНК (siRNA) [3] снизить количество POLA1 в нормальных клетках, у них тоже начинается воспаление. Все данные указывали на то, что полимераза POLA1 каким-то образом удерживает клетки от постоянного воспалительного ответа, то есть служит негативным регулятором иммунитета. Оставалось только понять, как такое может быть.

Молекулярная рутина

Дальше пошли бесконечные эксперименты с использованием всего оборудования, до которого мы могли дотянуться. С помощью микроскопии мы обнаружили, что значительная часть белка POLA1 находится в цитоплазме, что для ДНК-зависимой ДНК-полимеразы, опять же, довольно необычно. Тогда мы (вполне оправданно) стали искать точки соприкосновения POLA1 с другими известными цитоплазматическими регуляторами иммунного ответа. В клетках существует целый ряд иммунных сенсоров и сигнальных путей, и большинство этих белков при активации взаимодействует друг с другом напрямую. Мы даже разработали специальный метод, упрощающий поиск таких взаимодействий [4]. Однако в случае с POLA1 ничего не сработало — полимераза напрямую не входила в состав ни одного известного сигнального пути.

Следующим маневром была попытка определить, какой именно сигнальный путь регулируется полимеразой POLA1. С помощью киРНК мы снижали концентрацию POLA1 в культурах различных нормальных клеток до уровня больных (это называется нокдаун гена) и после этого проверяли, насколько клетки становились чувствительными к тому или иному иммунному стимулу. Надо сказать, клетки человека виртуозно могут распознавать всякую заразу с помощью не одного десятка различных рецепторов, и это существенно осложняет работу. Потому мы последовательно обрабатывали клетки всеми мыслимыми лигандами для толл-подобных рецепторов (TLR; рецепторы заражения, которых у человека с десяток, и каждый «чувствует» присутствие определенного типа бактерий или грибов).

Также мы стимулировали клетки интерлейкином-1 и TNF (универсальными воспалительными факторами, из-за которых у человека повышается температура и наступает болезненная усталость), а также имитировали вирусное заражение (что активирует внутриклеточные ДНК- и РНК-сенсоры, например, RIG-I, MAVS, STING). Логично было предположить, что если определенный сигнальный путь связан с POLA1, клетка с искусственным нокдауном POLA1 должна становиться гиперчувствительной только к определенному лиганду, а действие остальных стимулов не должно особо отличаться от контроля. Однако нас снова ожидал сюрприз: при нокдауне POLA1 большинство клеток приобретало гиперчувствительность ко всем стимулам сразу. Получалось чёрт-те что: никто из нас не слышал о существовании таких глобальных регуляторов всего иммунитета, а главное — мы до сих пор так и не поняли механизм.

Тут у нас закрались серьезные подозрения — вдруг мы прозевали какой-то очевидный фактор, который вызывает такой артефакт? Чтоб исключить возможные влияния на эксперимент наших биополей, барабашек и прочих потусторонних сил, мы обратились в несколько лабораторий с просьбой повторить ключевые опыты. Но все результаты подтвердились независимо от фазы Луны и месторасположения лабораторий. Стало ясно, что мы поймали нечто большее, чем просто мутацию.

Путь во тьме

Приблизиться к раскрытию механизма нам помогла случайность. В описанных выше экспериментах с киРНК мы заметили, что нокдаун POLA1 в одной из самых популярных лабораторных линий клеток — карциномы почки, НЕК293 — не вызывал ожидаемого воспаления. На тот момент мы просто отметили это и переключились на другие линии. Однако теперь мы вспомнили, почему клетки НЕК293 — одна из самых популярных лабораторных клеточных линий: они очень легко трансфецируются любой ДНК. А это происходит в частности из-за того, что в НЕК293 из-за ряда мутаций почти полностью отсутствуют внутренние антивирусные сенсоры, которые узнают проникшие в клетку вирусные молекулы РНК и ДНК. То, что именно эта клеточная линия оказалась единственной невосприимчивой системой к перепадам количества POLA1, дало нам решающую подсказку: наблюдаемый эффект каким-то образом должен быть связан с концентрацией нуклеиновых кислот в цитоплазме и способностью клетки различать нуклеиновые кислоты в цитоплазме по принципу «свой–чужой».

Известно, что клетки очень тщательно контролируют количество нуклеиновых кислот в цитоплазме. При инфекции вирусы впрыскивают свою ДНК (или РНК) внутрь клеток, и клеточные сенсоры распознают чужеродные нуклеиновые кислоты по целому ряду особенностей. При обнаружении чужеродной ДНК/РНК активируется интерфероновая защита — основа антивирусного ответа. Этот процесс включает арест метаболизма (чтобы вирусные частицы не успели собраться), секрецию интерферонов (оповещение соседних клеток и иммунной системы о заражении) и деградацию внутри клеток всего, что выглядит подозрительным (генеральная уборка, назовем это так). И то, что мы видели у клеточных линий больных с нашим синдромом, очень напоминало именно антивирусный ответ — с одной только разницей: клетки находились в стерильных условиях и вирусами не инфицировались.

Теперь, если соединить воедино всё, что мы знали о синдроме, картина наполнялась новым смыслом:

В целом всё указывало на то, что POLA1 каким-то образом уменьшает количество вирусной или собственной (например, ретротранспозонной) РНК или ДНК в цитоплазме. А если POLA1 отсутствует, то «мусорные» нуклеиновые кислоты накапливаются в цитоплазме и хронически активируют антивирусные сигнальные пути, что ведет к постоянному воспалению, которое мы видим у больных.

Это всё логично, но хотелось всё-таки понять механизм работы POLA1. Она не может напрямую уничтожать мусорную ДНК (как это делает ряд ферментов — например, TREX1 [8]), потому что POLA1 — одна из немногих полимераз с неактивным экзонуклеазным доменом. Кроме того, мы должны были научиться определять количество нуклеиновых кислот в цитоплазме, поскольку существующие методы — микроскопия или проточная цитометрия с использованием специфических антител к ДНК — работали на наших моделях из рук вон плохо, ведь нас интересовала только цитоплазма, а ядро, полное нуклеиновых кислот, неизменно давало очень высокий фоновый сигнал.

Сказка о потерянном времени

Параллельно возникла еще одна проблема: ввиду «горячей» информации (ведь на тот момент самым главным, что мы открыли, была мутация в гене POLA1) и большого количества соавторов, нас постоянно торопили с публикацией того, что есть — иначе любой другой генетик мог случайно наткнуться на интересную мутацию и опубликовать статью, тем самым нивелировав ценность наших изысканий.

Мы начали ощущать неслабое давление — мол, давайте не гнаться за топовыми журналами, опубликуем что есть в средненьком генетическом издании, а позже спокойно найдем механизм и опубликуем еще раз, тоже в хорошем молекулярном журнале. Нам (мне и моему руководителю) пришлось проявить недюжинные политические качества, убеждая коллабораторов в том, что мы почти закончили и что волноваться не стоит, и еще у нас есть парабеллум. Однако настроения это не поднимало — мы действительно не знали, с какой стороны подойти к механизму, а время всё утекало. Каждый новый вариант проверки требовал двух-трех месяцев напряженной работы, и у нас оставалось максимум две-три попытки до того момента, как коллабораторы потеряют последнее терпение.

Зеленый свет

Пасьянс сложился как-то вдруг. У нас уже был под рукой полный набор антител к нуклеиновым кислотам: к двух- и одноцепочечной ДНК, а также к РНК:ДНК-гибридным молекулам. Антитела работали неплохо, но мы не могли придумать нормального метода регистрации. И вдруг нас осенило: если цитоплазматическую фракцию клеток отделить от ядер (это легко), то тогда с помощью антител можно очистить именно цитоплазматические ДНК или ДНК:РНК. А если антитела прикрепить к сефарозным шарикам (Protein-G agarose beads — реактив, который традиционно используют в лабораториях для аффинной хроматографии), то эти шарики можно просто окрасить специфическим красителем для нуклеиновых кислот (с изобретением qPCR таких красителей продается много, и мы выбрали PicoGreen, потому что он зеленый и красивый), а потом сравнить уровни свечения под обычным микроскопом с ультрафиолетовой лампой.

Значит, если в цитоплазме много молекул ДНК или РНК:ДНК, шарики будут светиться ярко-зеленым, а если мало — то бледно-зеленым. Быстро обкатав методику, мы начали сравнивать цитоплазму в различных здоровых клетках и в клетках наших пациентов с синдромом XLRPD.

Первый же эксперимент поразил нас: у здоровых клеток в цитоплазме оказалось очень-очень много цитоплазматической РНК:ДНК. В цитоплазме же клеток наших больных РНК:ДНК-молекул не было практически совсем (рис. 3)! Ровно противоположный результат тому, что мы ожидали. Однако нас уже было не остановить.

Рисунок 3. Типичный результат анализа цитоплазматической РНК:ДНК в различных моделях клеток. а — Индивидуальные зерна сорбента с иммобилизированными РНК:ДНК-антителами (RNA:DNA) или неспецифическими контрольными антителами (IgG). Сравниваются три типа клеток — HEK293 и HeLa с POLA1-нокдауном, а также фибробласты здоровых людей и пациентов с XLPDR. Числа под картинками — относительная флуоресценция. б — Зерна сорбента при меньшем увеличении показывают сравнительное количество РНК:ДНК в цитоплазме пациентов с XLPDR и в тех же клетках после добавления в геном здоровой копии гена POLA1. Числа — относительная флуоресценция: как видно, разница более чем десятикратная.

Убедившись, что главное различие между здоровой клеткой и клеткой с дефицитом POLA1 — это загадочная РНК:ДНК в цитоплазме, мы в который раз с запозданием хлопнули себя по лбу. Ведь что гласит университетский курс по молекулярной биологии: фрагмент Оказаки — основной продукт POLA1 — представляет собой небольшую РНК-затравку, к которой полимераза добавляет ДНК-нуклеотиды. Получается, что POLA1 в свободное от репликации время синтезирует подобные РНК:ДНК-комплексы в цитоплазме.

Мы попробовали очистить эти цитоплазматические химеры и трансфецировать их в клетки больных синдромом XLPDR. Действительно, после этого воспаление на время пропадало. А значит, POLA1 постоянно синтезирует некие иммунологически инертные РНК:ДНК-комплексы (размером около 100 пар нуклеотидов), которые служат неким «белым шумом», не давая цитоплазматическим сенсорам перевозбуждаться из-за незначительных утечек нуклеиновых кислот, например, из ядра или при повреждении митохондрий. И только когда концентрация подозрительной ДНК превышает уровень шума, вся антивирусная система и запускается. По всему выходило, что задача POLA1 — постоянно производить «нуклеиновый шум», чтобы не допускать ложного срабатывания интерферонового ответа.

Публикация, в натуре

Мы сделали это! Обычно в сказках и в подростковых фильмах на этом месте начинаются титры, и герои уходят в даль, на закат. Увы, в реальности так элегантно не получается.

Во-первых, большинство было настроено скептически относительно публикации в топовом журнале — конкуренция там огромная, и любая даже очень хорошая статья может застрять на этапе рецензии на многие месяцы. Во-вторых, написать и оформить статью под подачу в каждый журнал занимает около месяца. А писать, естественно, приходилось нам самим — несмотря на обилие соавторов, реальную помощь оказывали единицы.

Мы начали по старшинству: август 2015 года — Science. Ответ через две недели — нет. Сентябрь 2015 — переписанная статья пошла в Nature. Ответ через полторы недели — нет. Октябрь 2015 — Nature Immunology, статья снова переписана и рисунки переделаны. И вдруг нам улыбнулась удача — ответ редактора пришел почти сразу: «Мне нравится, но давайте посмотрим, что скажут рецензенты». Через неделю все три рецензента ответили одинаково — будем брать. А дальше события развивались фантастически быстро: ответить на основные замечания у нас заняло всего месяц — почти все комментарии были по делу, и бόльшая часть материала у нас уже была на руках (мы его не включали в статью по причине экономии места, ведь объем текста и рисунков жестко регламентирован). Переделанная версия была отправлена на суд рецензентов, и позитивный ответ мы получили уже на следующий день. После трех лет работы над проектом это была поистине королевская награда [9]!

По-вашему, это финал?

Конечно, наша идея про РНК:ДНК-дуплексы в роли «нуклеинового шума» пока что только рабочая гипотеза. Мы до сих пор не смогли определить последовательность нуклеотидов в этих дуплексах, поэтому не представляем их источника и мишеней внутри клеток. Идея про «нуклеиновый шум» хоть и элегантна, но тоже еще не доказана. И в целом, вопросов на данный момент больше, чем ответов. Но одним из результатов этой работы всё-таки уже можно гордиться: мы теперь можем генотипировать сестер больных ребят — чтобы определить, являются ли они носителями мутации или могут не опасаться иметь детей в будущем. И мы наконец смогли рассказать десяти больным, почему они больны и что с ними не так, и теперь можем подсказать их лечащим врачам, в какую сторону следует корректировать их метаболизм. Потому что это ужасно — знать, что у тебя редкая болезнь, о которой известно одно лишь название. Да и то — до сих пор не переведенное на русский.

Источник