Что видно в электронный микроскоп в клетке
Что видно в электронный микроскоп в клетке
К началу 1900-х годов дальнейшее продвижение в изучении структуры клетки приостановилось, потому что даже самый совершенный световой микроскоп не мог обеспечить увеличение свыше 1500. Ограничение определялось самой природой света.
Свет — это одна из форм электромагнитного излучения, способного распространяться в виде последовательности волн. Глаз человека воспринимает электромагнитные излучения в диапазоне длин волн от 400 нм (фиолетовый цвет) до 700 нм (красный цвет).
Этот видимый свет составляет, однако, лишь небольшую часть полного электромагнитного спектра, включающего излучения с разной длиной волны. Излучения с любой длиной волны распространяются со скоростью света, но чем меньше длина волны, тем большую энергию она несет.
Нельзя разглядеть объект размером меньше половины длины волны используемого излучения, потому что объект должен быть достаточно велик, чтобы препятствовать прохождению воли. Мельчайший объект, который можно увидеть, используя видимый свет, должен быть поэтому не менее 200 нм в диаметре (половина длины волны в фиолетовой области спектра).
Учитывая размеры некоторых клеток и клеточных органелл (о них мы говорили выше), легко понять, что, например, митохондрии (1 мкм, или 1000 нм) должны выглядеть в световом микроскопе просто как какие-то мелкие гранулы внутри клеток. Рибосомы же в нем вообще не видны.
Следовательно, световой микроскоп не позволяет познакомиться с детальной структурой митохондрий, рибосом и других клеточных компонентов.
Отдавая себе отчет в этих ограничениях светового микроскопа, ученые предпринимали попытки сконструировать микроскоп, в котором использовалось бы излучение со значительно меньшей длиной волны.
Вначале для этого попытались использовать рентгеновские лучи, но вскоре выяснилось, что наилучшие результаты способен дать электронный микроскоп. В нем вместо светового излучения используется пучок электронов. Электроны — это отрицательно заряженные частицы, обращающиеся вокруг ядер атомов. При определенных условиях они ведут себя как волны. В сравнении с видимым светом они обладают двумя важными преимуществами.
Во-первых, у них чрезвычайно малая длина волны, почти такая же, как у рентгеновских лучей, и, во-вторых, поскольку они несут отрицательные заряды, их можно сфокусировать с помощью электромагнитных линз (электромагнитов).
Электромагнитные линзы направляют пучок электронов точно так же, как стеклянные линзы направляют пучок световых лучей.
Электронный микроскоп дает возможность получить для биологических объектов увеличение порядка 250 000. С некоторыми материалами удается достичь еше большего увеличения и теперь иногда получают даже изображения отдельных атомов.
— Вернуться в оглавление раздела «Биология.»
Органоиды, обнаруженные с помощью электронного микроскопа
Органоиды, или органеллы, – это специальные структуры клетки, которые выполняют жизненно важные для нее функции. Эти структуры подобны органам в человеческом организме, отсюда и взялось их название. Органоидов достаточно много, поэтому перечислим лишь некоторые из них: цитоплазма, митохондрии, аппарат Гольджи, лизосомы, вакуоли.
В данной статье мы рассмотрим органоиды, обнаруженные с помощью электронного микроскопа. У самого мощного светового микроскопа разрешающая способность объектива составляет примерно 200 нм. При этом сила разрешения определяется минимальным размером частицы, которую можно разглядеть в микроскоп. Именно поэтому до изобретения электронного микроскопа ряд клеточных органоидов оставался скрытым от глаз исследователей.
Какие органоиды можно увидеть в световой микроскоп? Только самые крупные, если можно так охарактеризовать мельчайшие частицы. Можно разглядеть пластиды и ядро клетки. С появлением электронного микроскопа представления ученых о клетке и ее органоидах существенно изменились, ведь его разрешающая способность достигает значения в 0,1 нм.
Какие органоиды обнаружены с помощью электронного микроскопа
Как выяснилось, у клетки есть и другие немаловажные элементы. В частности, это такие органеллы (постоянные компоненты клетки), как митохондрии и рибосомы, а также части структуры цитоплазмы (аппарат Гольджи, эндоплазматическая сеть). Самыми маленькими из обнаруженных электронным микроскопом органелл клетки считаются рибосомы.
Исследования клеточной структуры, проведенные с использованием электронного микроскопа, наглядно продемонстрировали, что клетку можно считать сложной системой, состоящей из отдельных органоидов, которые невидимы в световой микроскоп.
4glaza.ru
Февраль 2018
Использование материала полностью для общедоступной публикации на носителях информации и любых форматов запрещено. Разрешено упоминание статьи с активной ссылкой на сайт www.4glaza.ru.
Производитель оставляет за собой право вносить любые изменения в стоимость, модельный ряд и технические характеристики или прекращать производство изделия без предварительного уведомления.
Электронный микроскоп и клетка
Человеческий глаз представляет собой превосходную оптическую систему. С его помощью мы видим отдаленные миллионами километров планеты и звезды; можем рассмотреть мельчайшие частички пыли, пляшущие в воздухе в луче света. Однако во многих случаях, когда надо глубже разобраться в строении изучаемых предметов, глаз начинает изменять нам. Тогда на помощь приходят оптические приборы. С момента, когда живший в семнадцатом веке голландский торговец сукном Левенгук дополнил глаз набором увеличительных стекол своего примитивного микроскопа, и до сегодняшнего дня ученые и изобретатели трудятся над изготовлением приборов, позволяющих глубже заглянуть в мир мельчайших частиц. Долгое время все усилия были направлены на совершенствование оптических приборов.
С помощью современного светового микроскопа можно получить изображение объекта, увеличенного до двух тысяч раз. Можно сделать микроскоп, дающий и значительно большие увеличения. Но при этом выигрыша в выявлении новых деталей мы не получим, так как это — чисто масштабное увеличение, а не полезное. Предел полезного увеличения был достигнут для светового микроскопа еще в конце 19-го столетия. Он определяется так называемым разрешаемым расстоянием, то есть расстоянием между двумя наиболее близко расположенными точками, видимыми раздельно. Обычно пользуются обратным отношением этой величины, называемой разрешающей способностью. У современных микроскопов разрешаемое расстояние зависит от длины волны света и не может быть менее 0,15—0,2 микрона или 1 500—2 000 ангстрем. Это составляет примерно половину длины волны света. Чтобы убедится в этом можете попробовать сами купить микроскоп мпб 2.
Единственный путь дальнейшего увеличения разрешающей способности микроскопа — уменьшить длину волны излучения, применяемого для получения изображения. Как известно, световой спектр представляет гамму различных длин волн; самая короткая — у фиолетовой и ультрафиолетовой части. Поэтому, используя в микроскопе особые лампы с ультрафиолетовым излучением, возможно несколько улучшить разрешение.
Еще более выгодно было бы использовать лучи Рентгена, длина волны которых во много раз меньше. Теоретически с помощью «рентгеновского микроскопа» можно было бы рассматривать молекулы и даже атомы. К сожалению, разрешение созданных моделей таких микроскопов пока не больше, чем у светового. Выход из создавшегося тупика был найден в другой области.
В 100 ТЫСЯЧ РАЗ МЕНЬШЕ
Еще во второй половине девятнадцатого века были построены приборы, послужившие в дальнейшем прообразом современных телевизоров и электронных микроскопов. Принцип их работы один: лоток электронов вызывает свечение люминофоров. На экране в месте, куда ударяет поток электронов, появляется яркая точка. В такого рода трубках удавалось получать даже своеобразные картинки, правда, скорее ради курьеза.
В 1924 году французский физик де Бройль обнаружил интересную особенность быстро летящих в вакууме электродов. Оказалось, что они обладают волновыми свойствами с длиной волны значительно меньшей, чем у лучей света. При этом длина волны зависит от скорости, а скорость движения электронов, как было давно известно, увеличивается при увеличении разности потенциалов между электродами. Немедленно встал вопрос о возможности применения потока электронов для получения изображения в микроскопе. Это было весьма соблазнительно, так как длина волны электронов меньше длины волны света примерно в 100 тысяч раз. Соответственно во столько же раз можно было бы увеличить разрешающую способность микроскопа.
Применить для такого микроскопа обычные, стеклянный линзы оказалось невозможным. Однако в связи с тем, что законы движения электронов в электрическом и магнитном поле до известной степени аналогичны закону преломления световой оптики, удалось создать магнитные поля такой формы, в которых пучок электронов ведет себя подобно пучку света, проходящему сквозь стеклянную линзу. Выходя из какой-то точки, они собираются вновь в другой точке или в фокусе. Такая линза дает возможность получить электронно-микроскопическое изображение объекта. На этом принципе и построен электронный микроскоп.
ВТОРЖЕНИЕ В ОБЛАСТЬ НЕВЕДОМОГО
Первые электронные микроскопы были построены к началу тридцатых годов, через несколько лет после открытия де Бройля, и очень быстро нашли широкое применение во всем мире.
К моменту создания электронного микроскопа в биологии, особенно в цитологии — науке, занимающейся изучением строения и функции клеток, наметился своеобразный разрыв. С помощью светового микроскопа можно было наблюдать и изучать то, что лежит в пределах 1000—2000 ангстрем. В то же время широко развернувшиеся работы биохимиков и биофизиков позволили заглянуть в мир молекул — частиц размеров менее-10—15 ангстрем. Средняя же область — между микроскопической цитологией и макромолекулярной химией — оставалась совершенно неизведанной.
Возникал вопрос: не таятся ли здесь новые структуры, имеющие определенную организацию? Изучить их особенно важно потому, что они связаны с характером макромолекул белков, нуклеиновых кислот и жиров, то есть веществ, от которых зависит большинство процессов, протекающих в клетках. На этом же макромолекулярном уровне возникают и первичные изменения при многих заболеваниях. Здесь таится разгадка многих неясных до настоящего времени болезней. Открыть эту неведомую область предстояло электронным микроскопистам.
ПЕРВЫЙ ЭТАП — НАКОПЛЕНИЕ ФАКТОВ
Изучение цитологических структур — элементов клетки — с помощью электронного микроскопа только начинается. Как во всякой развивающейся науке, этап подготовки методов исследования сменился периодом накопления фактов. Клетки растений и животных, грибов и бактерий, одноклеточные организмы в новом свете предстают перед учеными. Еще и сейчас многие органы и ткани почти совершенно не описаны и ждут своего исследователя.
Основным методом изучения внутреннего строения клеток и тканей в электроном микроскопе, так же как и в световом, является просмотр их «в проходящем свете». Только так удается выявить наиболее важные и интересные данные об их внутренней организации. Однако первые же опыты показали, что здесь исследователей ожидают большие трудности. Даже отдельные распластанные клетки настолько сильно поглощали электроны, что на экране большая их часть выглядела совершенно непрозрачной. Лишь по краям, в самых тонких участках, удавалось наблюдать отдельные клеточные структуры. Получение необычайно тонких, до 100 — 300 ангстрем толщиной, проницаемых для электронов срезов клеток — само по себе проблема! Она была решена.
Но возникли новые затруднения. Биологические объекты обычно имеют небольшую разницу в «электронной плотности» разных участков — обладают низким контрастом. Поэтому изображение даже сверхтонких срезов клетки оказывается нечетким. Контраст увеличивают искусственно, вводя в клетки вещества, задерживающие электроны. Для этой цели главным образом используются тяжелые металлы: золото, осмий, свинец, уран и т. д. Соединяясь с определенными веществами клетки, эти металлы выявляют их структуры, выполняя роль своеобразного «красителя».
Новую страну первым исследует географ. Он опишет озера, горы и низменности, протекающие там реки. На карте появятся леса, степи, даже ручьи. Но многое останется невыявленным. Страна лишь приоткрыла свои богатства. Нужно, чтобы вслед за географом прошли геологические партии, сделали глубокие шурфы и пробурили скважины. Тогда на карте возникнет россыпь полезных ископаемых, мимо которых, не заметив их, прошел географ, вооруженный лишь компасом и биноклем.
История исследования клетки в световом микроскопе насчитывает более ста лет. За это время были изучены и описаны разнообразные клеточные структуры, прослежены различные изменения клеток в процессе их деления и роста, перестройки в измененных болезнью тканях. Известно, что клетки окружены оболочкой, внутри которой заключена жидкая цитоплазма и центрально расположенное ядро. Известно, что в цитоплазме, кроме гомогенного (или основного) вещества, находятся различные включения, в числе которых имеются так называемые органоиды. К ним относятся, например, митохондрии.
Митохондрии встречаются почти во всех клетках, причем иногда в огромном количестве. Химики определили, что митохондрии содержат сложный состав ферментов и играют огромную роль во многих процессах клетки. Но вся эта «фабрика», вернее, «химический завод», в световом микроскопе выглядела более чем просто: в виде маленькой точки или, в лучшем случае, черной палочки. Как же там действует сложнейший комплекс ферментов? Где они размещаются?
Посмотрим на митохондрию в электронный микроскоп. Она уже не похожа на простое зернышко или палочку. Перед нами сложная система, состоящая из двойной оболочки, окружающей удлиненное тело; внутри правильными рядами расположены многочисленные, также двойные перегородки. Вещество, лежащее между перегородками, имеет определенные свойства, отличающие его от окружающей цитоплазмы. Более того: митохондрии у разных животных (и даже у одного организма, но в разных тканях) также различны. У некоторых насекомых, например, митохондрии округлой, а не вытянутой формы. Перегородки заменяются гребнями, то радиусам отходящими внутрь от оболочки; вместо пластинок-гребней могут быть трубочки, похожие на сильно вытянутые пальцы от резиновой перчатки.
Но во всех случаях внутренние перегородки, будь-то гребни или трубочки, построены из тонких (около 150 ангстрем) двойных пластинок — мембран. Такая общность строения объясняется тем, что роль митохондрии одинакова: осуществление определенных ферментных реакций.
При исследовании «вглубь» по-иному предстало и основное вещество цитоплазмы клеток. В световом микроскопе оно выглядело по-разному. Дело в том, что живая клетка при изучении обычно фиксируется — убивается. При этом внутреннее строение ее в той или иной степени нарушается: иногда становится бесструктурным, иногда грубозернистым, нередко заполняется массой пузырьков, так как происходит свертывание белков.
Совсем иную картину дает электронный микроскоп: перед нами целая сеть нитей, трубочек, пузырьков. Все они ограничены тончайшими (примерно такими же, как у митохондрий) мембранами, часто усеянными мелкими зернышками. Эти структуры, получившие название эргастоплазменной сети, впервые представ перед исследователями, вызвали массу споров. Многие не верили в их реальность: настолько это было ново и неожиданно. Сейчас дискуссии постепенно затихают. Такие сети обнаружены почти во всех клетках. Начинает проясняться их важная роль. Установлена связь эргастоплазменной сети с особыми участками клетки — базофильными структурами.
Связь осуществляется через мелкие зернышки, усеивающие мембраны эргастоплазмы. Эти зернышки содержат одно из важнейших веществ клетки — рибонуклеиновую кислоту, которая играет активную роль в синтезе белка. Действительно, наиболее значительное скопление эргастоплазменной сети обнаруживается как раз в тех клетках, которые вырабатывают белки (например, поджелудочная железа).
На электронно-микроскопической фотографии среди массы беспорядочно расположенных пузырьков и канальцев эргастоплазменной сети наше внимание обращают группы парных мембран, лежащих правильными рядами. Это хорошо знакомый исследователям сетчатый аппарат Гольджи, который связывают с жизнедеятельностью клетки и ее функциями выделения. Впервые он был описан еще в 1898 году. И, тем не менее, в каждом отдельном случае возникал вопрос, имеем ли мы дело с аппаратом Гольджи или сетью структур, сходных по окраске. Электронно-микроскопическое исследование сразу вносит полную ясность. На фото видны пакеты парных мембран, вокруг которых располагаются отдельные крупные пузырьки, или вакуоли, более мелкие многочисленные вакуоли лежат внутри самих пакетов между пластинами мембраны.
Поражает интересная закономерность: в аппарате Гольджи и в митохондриях, в эргастоплазменной сети и в клеточных оболочках — всюду электронный микроскоп выявляет мембраны, довольно сходные между собой по толщине и по плотности. В чем дело?
Объясняют это тем, что именно мембраны — очень удачная система, где при наименьшем объеме возможно наилучшее взаимодействие. Молекулы вещества лежат здесь почти в один слой с окружающей цитоплазмой, включаются практически одновременно в реакцию обмена веществ.
ЭЛЕКТРОННЫЙ МИКРОСКОП
ЭЛЕКТРОННЫЙ МИКРОСКОП, прибор, который позволяет получать сильно увеличенное изображение объектов, используя для их освещения электроны. Электронный микроскоп (ЭМ) дает возможность видеть детали, слишком мелкие, чтобы их мог разрешить световой (оптический) микроскоп. ЭМ – один из важнейших приборов для фундаментальных научных исследований строения вещества, особенно в таких областях науки, как биология и физика твердого тела.
Существуют три основных вида ЭМ. В 1930-х годах был изобретен обычный просвечивающий электронный микроскоп (ОПЭМ), в 1950-х годах – растровый (сканирующий) электронный микроскоп (РЭМ), а в 1980-х годах – растровый туннельный микроскоп (РТМ). Эти три вида микроскопов дополняют друг друга в исследованиях структур и материалов разных типов.
ОБЫЧНЫЙ ПРОСВЕЧИВАЮЩИЙ ЭЛЕКТРОННЫЙ МИКРОСКОП
Электронная оптика.
Электронное изображение формируется электрическими и магнитными полями примерно так же, как световое – оптическими линзами. Принцип действия магнитной линзы поясняется схемой (рис. 1). Магнитное поле, создаваемое витками катушки, по которой проходит ток, действует как собирающая линза, фокусное расстояние которой можно изменять, изменяя ток. Поскольку оптическая сила такой линзы, т.е. способность фокусировать электроны, зависит от напряженности магнитного поля вблизи оси, для ее увеличения желательно сконцентрировать магнитное поле в минимально возможном объеме. Практически это достигается тем, что катушку почти полностью закрывают магнитной «броней» из специального никель-кобальтового сплава, оставляя лишь узкий зазор в ее внутренней части. Создаваемое таким образом магнитное поле может быть в 10–100 тыс. раз более сильным, чем магнитное поле Земли на земной поверхности.
Схема ОПЭМ представлена на рис. 2. Ряд конденсорных линз (показана лишь последняя) фокусирует электронный пучок на образце. Обычно первая из них создает неувеличенное изображение источника электронов, а последняя контролирует размер освещаемого участка на образце. Диафрагмой последней конденсорной линзы определяется ширина пучка в плоскости объекта. Образец помещается в магнитном поле объективной линзы с большой оптической силой – самой важной линзы ОПЭМ, которой определяется предельное возможное разрешение прибора. Аберрации объективной линзы ограничиваются ее диафрагмой так же, как это происходит в фотоаппарате или световом микроскопе. Объективная линза дает увеличенное изображение объекта (обычно с увеличением порядка 100); дополнительное увеличение, вносимое промежуточными и проекционной линзами, лежит в пределах величин от несколько меньшей 10 до несколько большей 1000. Таким образом, увеличение, которое можно получить в современных ОПЭМ, составляет от менее 1000 до
1 000 000. (При увеличении в миллион раз грейпфрут вырастает до размеров Земли.) Исследуемый объект обычно помещают на очень мелкую сетку, вкладываемую в специальный держатель. Держатель можно механическим или электрическим способом плавно перемещать вверх-вниз и вправо-влево.
Изображение.
Контраст в ОПЭМ обусловлен рассеянием электронов при прохождении электронного пучка через образец. Если образец достаточно тонок, то доля рассеянных электронов невелика. При прохождении электронов через образец одни из них рассеиваются из-за столкновений с ядрами атомов образца, другие – из-за столкновений с электронами атомов, а третьи проходят, не претерпевая рассеяния. Степень рассеяния в какой-либо области образца зависит от толщины образца в этой области, его плотности и средней атомной массы (числа протонов) в данной точке. Электроны, выходящие из диафрагмы с угловым отклонением, превышающим некоторый предел, уже не могут вернуться в пучок, несущий изображение, а поэтому сильно рассеивающие участки повышенной плотности, увеличенной толщины, места расположения тяжелых атомов выглядят на изображении как темные зоны на светлом фоне. Такое изображение называется светлопольным, поскольку на нем окружающее поле светлее объекта. Но можно сделать так, чтобы электрическая отклоняющая система пропускала в диафрагму объектива только те или иные из рассеянных электронов. Тогда образец выглядит светлым на темном поле. Слабо рассеивающий объект часто бывает удобнее рассматривать в режиме темного поля.
Окончательное увеличенное электронное изображение преобразуется в видимое посредством люминесцентного экрана, который светится под действием электронной бомбардировки. Это изображение, обычно слабоконтрастное, как правило, рассматривают через бинокулярный световой микроскоп. При той же яркости такой микроскоп с увеличением 10 может создавать на сетчатке глаза изображение, в 10 раз более крупное, чем при наблюдении невооруженным глазом. Иногда для повышения яркости слабого изображения применяется люминофорный экран с электронно-оптическим преобразователем. В этом случае окончательное изображение может быть выведено на обычный телевизионный экран, что позволяет записать его на видеоленту. Видеозапись применяется для регистрации изображений, меняющихся во времени, например, в связи с протеканием химической реакции. Чаще всего окончательное изображение регистрируется на фотопленке или фотопластинке. Фотопластинка обычно позволяет получить более четкое изображение, чем наблюдаемое простым глазом или записанное на видеоленте, так как фотоматериалы, вообще говоря, более эффективно регистрируют электроны. Кроме того, на единице площади фотопленки может быть зарегистрировано в 100 раз больше сигналов, чем на единице площади видеоленты. Благодаря этому изображение, зарегистрированное на фотопленке, можно дополнительно увеличить примерно в 10 раз без потери четкости.
Разрешение.
Электронные пучки имеют свойства, аналогичные свойствам световых пучков. В частности, каждый электрон характеризуется определенной длиной волны. Разрешающая способность ЭМ определяется эффективной длиной волны электронов. Длина волны зависит от скорости электронов, а следовательно, от ускоряющего напряжения; чем больше ускоряющее напряжение, тем больше скорость электронов и тем меньше длина волны, а значит, выше разрешение. Столь значительное преимущество ЭМ в разрешающей способности объясняется тем, что длина волны электронов намного меньше длины волны света. Но поскольку электронные линзы не так хорошо фокусируют, как оптические (числовая апертура хорошей электронной линзы составляет всего лишь 0,09, тогда как для хорошего оптического объектива эта величина достигает 0,95), разрешение ЭМ равно 50–100 длинам волн электронов. Даже со столь слабыми линзами в электронном микроскопе можно получить предел разрешения ок. 0,17 нм, что позволяет различать отдельные атомы в кристаллах. Для достижения разрешения такого порядка необходима очень тщательная настройка прибора; в частности, требуются высокостабильные источники питания, а сам прибор (который может быть высотой ок. 2,5 м и иметь массу в несколько тонн) и его дополнительное оборудование требуют монтажа, исключающего вибрацию.
РАСТРОВЫЙ ЭЛЕКТРОННЫЙ МИКРОСКОП
РЭМ, ставший важнейшим прибором для научных исследований, служит хорошим дополнением ОПЭМ. В РЭМ применяются электронные линзы для фокусировки электронного пучка в пятно очень малых размеров. Можно отрегулировать РЭМ так, чтобы диаметр пятна в нем не превышал 0,2 нм, но, как правило, он составляет единицы или десятки нанометров. Это пятно непрерывно обегает некоторый участок образца аналогично лучу, обегающему экран телевизионной трубки. Электрический сигнал, возникающий при бомбардировке объекта электронами пучка, используется для формирования изображения на экране телевизионного кинескопа или электронно-лучевой трубки (ЭЛТ), развертка которой синхронизирована с системой отклонения электронного пучка (рис. 3). Увеличение в данном случае понимается как отношение размера изображения на экране к размеру области, обегаемой пучком на образце. Это увеличение составляет от 10 до 10 млн.
Взаимодействие электронов сфокусированного пучка с атомами образца может приводить не только к их рассеянию, которое используется для получения изображения в ОПЭМ, но и к возбуждению рентгеновского излучения, испусканию видимого света и эмиссии вторичных электронов. Кроме того, поскольку в РЭМ перед образцом имеются только фокусирующие линзы, он позволяет исследовать «толстые» образцы.
Отражательный РЭМ.
Отражательный РЭМ предназначен для исследования массивных образцов. Поскольку контраст, возникающий при регистрации отраженных, т.е. обратно-рассеянных, и вторичных электронов, связан в основном с углом падения электронов на образец, на изображении выявляется поверхностная структура. (Интенсивность обратного рассеяния и глубина, на которой оно происходит, зависят от энергии электронов падающего пучка. Эмиссия вторичных электронов определяется, в основном составом поверхности и электропроводностью образца.) Оба эти сигнала несут информацию об общих характеристиках образца. Благодаря малой сходимости электронного пучка можно проводить наблюдения с гораздо большей глубиной резкости, чем при работе со световым микроскопом, и получать прекрасные объемные микрофотографии поверхностей с весьма развитым рельефом. Регистрируя рентгеновское излучение, испускаемое образцом, можно в дополнение к данным о рельефе получать информацию о химическом составе образца в поверхностном слое глубиной
0,001 мм. О составе материала на поверхности можно судить и по измеренной энергии, с которой эмиттируются те или иные электроны.
Все сложности работы с РЭМ обусловлены, в основном, его системами регистрации и электронной визуализации. В приборе с полным комплексом детекторов, наряду со всеми функциями РЭМ, предусматривается рабочий режим электронно-зондового микроанализатора.
Растровый просвечивающий электронный микроскоп.
Растровый просвечивающий электронный микроскоп (РПЭМ) – это особый вид РЭМ. Он рассчитан на тонкие образцы, такие же, как и исследуемые в ОПЭМ. Схема РПЭМ отличается от схемы на рис. 3 только тем, что в ней нет детекторов, расположенных выше образца. Поскольку изображение формируется бегущим пучком (а не пучком, освещающим весь исследуемый участок образца), требуется высокоинтенсивный источник электронов, чтобы изображение можно было зарегистрировать за приемлемое время. В РПЭМ высокого разрешения используются автоэлектронные эмиттеры высокой яркости. В таком источнике электронов создается очень сильное электрическое поле (ок. 
В/см) вблизи поверхности заостренной травлением вольфрамовой проволочки очень малого диаметра. Это поле буквально вытягивает миллиарды электронов из проволочки без всякого нагрева. Яркость такого источника почти в 10 000 раз больше, чем источника с нагреваемой вольфрамовой проволокой (см. выше), а испускаемые им электроны могут быть сфокусированы в пучок диаметром менее 1 нм. Были даже получены пучки, диаметр которых близок к 0,2 нм.
Автоэлектронные источники могут работать только в условиях сверхвысокого вакуума (при давлениях ниже 
Па), в которых полностью отсутствуют такие загрязнения, как пары углеводородов и воды, и становится возможным получение изображений с высоким разрешением. Благодаря таким сверхчистым условиям можно исследовать процессы и явления, недоступные ЭМ с обычными вакуумными системами.
Исследования в РПЭМ проводятся на сверхтонких образцах. Электроны проходят сквозь такие образцы почти без рассеяния. Электроны, рассеянные на углы более нескольких градусов без замедления, регистрируются, попадая на кольцевой электрод, расположенный под образцом (рис. 3). Сигнал, снимаемый с этого электрода, сильно зависит от атомного номера атомов в той области, через которую проходят электроны, – более тяжелые атомы рассеивают больше электронов в направлении детектора, чем легкие. Если электронный пучок сфокусирован в точку диаметром менее 0,5 нм, то можно получить изображение отдельных атомов. Реально удается различать на изображении, полученном в РПЭМ, отдельные атомы с атомной массой железа (т.е. 26 и более).
Электроны, не претерпевшие рассеяния в образце, а также электроны, замедлившиеся в результате взаимодействия с образцом, проходят в отверстие кольцевого детектора. Энергетический анализатор, расположенный под этим детектором, позволяет отделить первые от вторых. Измеряя энергию, потерянную электронами при рассеянии, можно получить важную информацию об образце. Потери энергии, связанные с возбуждением рентгеновского излучения или выбиванием вторичных электронов из образца, позволяют судить о химических свойствах вещества в области, через которую проходит электронный пучок.
РАСТРОВЫЙ ТУННЕЛЬНЫЙ МИКРОСКОП
В ЭМ, рассмотренных выше, для фокусировки электронов применяются магнитные линзы. Данный раздел посвящен ЭМ без линз. Но, прежде чем переходить к растровому туннельному микроскопу (РТМ), будет полезно кратко остановиться на двух старых видах безлинзового микроскопа, в которых формируется проецированное теневое изображение.
Автоэлектронный и автоионный проекторы.
Автоэлектронный источник, применяемый в РПЭМ, с начала 1950-х годов применялся в теневых проекторах. В автоэлектронном проекторе электроны, испускаемые за счет автоэлектронной эмиссии острием очень малого диаметра, ускоряются в направлении люминесцентного экрана, расположенного на расстоянии нескольких сантиметров от острия. В результате на экране возникает проецированное изображение поверхности острия и находящихся на этой поверхности частиц с увеличением, равным отношению радиуса экрана к радиусу острия (порядка 
). Более высокое разрешение достигается в автоионном проекторе, в котором проецирование изображения осуществляется ионами гелия (или некоторых других элементов), эффективная длина волны которых меньше, чем у электронов. Это позволяет получать изображения, показывающие истинное расположение атомов в кристаллической решетке материала острия. Поэтому автоионные проекторы используются, в частности, для исследования кристаллической структуры и ее дефектов в материалах, из которых могут быть изготовлены такие острия.
Растровый туннельный микроскоп (РТМ).
В этом микроскопе тоже используется металлическое острие малого диаметра, являющееся источником электронов. В зазоре между острием и поверхностью образца создается электрическое поле. Число электронов, вытягиваемых полем из острия в единицу времени (ток туннелирования), зависит от расстояния между острием и поверхностью образца (на практике это расстояние меньше 1 нм). При перемещении острия вдоль поверхности ток модулируется. Это позволяет получить изображение, связанное с рельефом поверхности образца. Если острие заканчивается одиночным атомом, то можно сформировать изображение поверхности, проходя атом за атомом.
РТМ может работать только при условии, что расстояние от острия до поверхности постоянно, а острие можно перемещать с точностью до атомных размеров. Вибрации подавляются благодаря жесткой конструкции и малым размерам микроскопа (не более кулака), а также применению многослойных резиновых амортизаторов. Высокую точность обеспечивают пьезоэлектрические материалы, которые удлиняются и сокращаются под действием внешнего электрического поля. Подавая напряжение порядка 10 –5 В, можно изменять размеры таких материалов на 0,1 нм и менее. Это дает возможность, закрепив острие на элементе из пьезоэлектрического материала, перемещать его в трех взаимно перпендикулярных направлениях с точностью порядка атомных размеров.
ТЕХНИКА ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ
Вряд ли остался какой-либо сектор исследований в области биологии и материаловедения, где бы не применялась просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ); это обеспечено успехами техники приготовления образцов.
Все применяемые в электронной микроскопии методики нацелены на получение предельно тонкого образца и обеспечение максимального контраста между ним и подложкой, которая необходима ему в качестве опоры. Основная методика рассчитана на образцы толщиной 2–200 нм, поддерживаемые тонкими пластмассовыми или углеродными пленками, которые кладутся на сетку с размером ячейки ок. 0,05 мм. (Подходящий образец, каким бы способом он ни был получен, обрабатывается так, чтобы увеличить интенсивность рассеяния электронов на исследуемом объекте.) Если контраст достаточно велик, то глаз наблюдателя может без напряжения различить детали, находящиеся на расстоянии 0,1–0,2 мм друг от друга. Следовательно, для того, чтобы на изображении, создаваемом электронным микроскопом, были различимы детали, разделенные на образце расстоянием в 1 нм, необходимо полное увеличение порядка 100–200 тыс. Лучшие из микроскопов могут создать на фотопластинке изображение образца с таким увеличением, но при этом изображается слишком малый участок. Обычно делают микроснимок с меньшим увеличением, а затем увеличивают его фотографически. Фотопластинка разрешает на длине 10 см ок. 10 000 линий. Если каждая линия соответствует на образце некой структуре протяженностью 0,5 нм, то для регистрации такой структуры необходимо увеличение не менее 20 000, тогда как при помощи РЭМ и РПЭМ, в которых изображение регистрируется электронной системой и развертывается на телевизионном экране, может быть разрешено только ок. 1000 линий. Таким образом, при использовании телевизионного монитора минимально необходимое увеличение примерно в 10 раз больше, чем при фоторегистрации.
Биологические препараты.
Электронная микроскопия широко применяется в биологических и медицинских исследованиях. Разработаны методики фиксации, заливки и получения тонких срезов тканей для исследования в ОПЭМ и РПЭМ и методики фиксации для исследования объемных образцов в РЭМ. Эти методики дают возможность исследовать организацию клеток на макромолекулярном уровне. Электронная микроскопия выявила компоненты клетки и детали строения мембран, митохондрий, эндоплазматической сети, рибосом и множества других органелл, входящих в состав клетки. Образец сначала фиксируют глутаральдегидом или другими фиксирующими веществами, а затем обезвоживают и заливают пластмассой. Методы криофиксации (фиксации при очень низких – криогенных – температурах) позволяют сохранить структуру и состав без использования химических фиксирующих веществ. Кроме того, криогенные методы позволяют получать изображения замороженных биологических образцов без их обезвоживания. При помощи ультрамикротомов с лезвиями из полированного алмаза или сколотого стекла можно делать срезы тканей толщиной 30–40 нм. Смонтированные гистологические препараты могут быть окрашены соединениями тяжелых металлов (свинца, осмия, золота, вольфрама, урана) для усиления контраста отдельных компонентов или структур.
Биологические исследования были распространены на микроорганизмы, особенно на вирусы, которые не разрешаются световыми микроскопами. ПЭМ позволила выявить, например, структуры бактериофагов и расположение субъединиц в белковых оболочках вирусов. Кроме того, методами позитивного и негативного окрашивания удалось выявить структуру с субъединицами в ряде других важных биологических микроструктур. Методы усиления контраста нуклеиновых кислот позволили наблюдать одно- и двунитные ДНК. Эти длинные линейные молекулы распластывают в слой основного белка и накладывают на тонкую пленку. Затем на образец вакуумным напылением наносят очень тонкий слой тяжелого металла. Этот слой тяжелого металла «оттеняет» образец, благодаря чему последний при наблюдении в ОПЭМ или РПЭМ выглядит как бы освещенным с той стороны, с которой напылялся металл. Если же вращать образец во время напыления, то металл накапливается вокруг частиц со всех сторон равномерно (как снежный ком).
Небиологические материалы.
ПЭМ применяется в исследованиях материалов для изучения тонких кристаллов и границ между разными материалами. Чтобы получить изображение границы раздела с большим разрешением, образец заливают пластмассой, делают срез образца, перпендикулярный границе, а затем утоньшают его так, чтобы граница была видна на заостренной кромке. Кристаллическая решетка сильно рассеивает электроны в определенных направлениях, давая дифракционную картину. Изображение кристаллического образца в значительной мере определяется этой картиной; контраст сильно зависит от ориентации, толщины и совершенства кристаллической решетки. Изменения контраста на изображении позволяют изучать кристаллическую решетку и ее несовершенства в масштабе атомных размеров. Получаемая при этом информация дополняет ту, которую дает рентгенографический анализ объемных образцов, так как ЭМ дает возможность непосредственно видеть во всех деталях дислокации, дефекты упаковки и границы зерен. Кроме того, в ЭМ можно снимать электронограммы и наблюдать картины дифракции от выделенных участков образца. Если диафрагму объектива настроить так, чтобы через нее проходили только один дифрагированный и нерассеянный центральный пучки, то можно получать изображение определенной системы кристаллических плоскостей, которая дает этот дифрагированный пучок. Современные приборы позволяют разрешать периоды решетки величиной 0,1 нм. Исследовать кристаллы можно также методом темнопольного изображения, при котором перекрывают центральный пучок, так что изображение формируется одним или несколькими дифрагированными пучками. Все эти методы дали важную информацию о структуре очень многих материалов и существенно прояснили физику кристаллов и их свойства. Например, анализ ПЭМ-изображений кристаллической решетки тонких малоразмерных квазикристаллов в сочетании с анализом их электронограмм позволил в 1985 открыть материалы с симметрией пятого порядка.
Высоковольтная микроскопия.
В настоящее время промышленность выпускает высоковольтные варианты ОПЭМ и РПЭМ с ускоряющим напряжением от 300 до 400 кВ. Такие микроскопы имеют более высокую проникающую способность, чем у низковольтных приборов, причем почти не уступают в этом отношении микроскопам с напряжением 1 млн. вольт, которые строились в прошлом. Современные высоковольтные микроскопы достаточно компактны и могут быть установлены в обычном лабораторном помещении. Их повышенная проникающая способность оказывается очень ценным свойством при исследовании дефектов в более толстых кристаллах, особенно таких, из которых невозможно сделать тонкие образцы. В биологии их высокая проникающая способность дает возможность исследовать целые клетки, не разрезая их. Кроме того, с помощью таких микроскопов можно получать объемные изображения толстых объектов.
Низковольтная микроскопия.
Выпускаются также РЭМ с ускоряющим напряжением, составляющим всего несколько сот вольт. Даже при столь низких напряжениях длина волны электронов меньше 0,1 нм, так что пространственное разрешение и здесь ограничивается аберрациями магнитных линз. Однако, поскольку электроны с такой низкой энергией проникают неглубоко под поверхность образца, почти все электроны, участвующие в формировании изображения, приходят из области, расположенной очень близко к поверхности, благодаря чему повышается разрешение поверхностного рельефа. С помощью низковольтных РЭМ были получены изображения на твердых поверхностях объектов размером менее 1 нм.
Радиационное повреждение.
Поскольку электроны представляют собой ионизирующее излучение, образец в ЭМ постоянно подвергается его воздействию. (В результате этого воздействия возникают вторичные электроны, используемые в РЭМ.) Следовательно, образцы всегда подвергаются радиационному повреждению. Типичная доза излучения, поглощаемая тонким образцом за время регистрации микрофотографии в ОПЭМ, примерно соответствует энергии, которой было бы достаточно для полного испарения холодной воды из пруда глубиной 4 м с площадью поверхности 1 га. Чтобы уменьшить радиационное повреждение образца, необходимо использовать различные методы его подготовки: окрашивание, заливку, замораживание. Кроме того, можно регистрировать изображение при дозах электронов, в 100–1000 раз меньших, нежели по стандартной методике, а затем улучшать его методами компьютерной обработки изображений.
ИСТОРИЧЕСКАЯ СПРАВКА
История создания электронного микроскопа – замечательный пример того, как самостоятельно развивающиеся области науки и техники могут, обмениваясь полученной информацией и объединяя усилия, создавать новый мощный инструмент научных исследований. Вершиной классической физики была теория электромагнитного поля, которая объяснила распространение света, возникновение электрических и магнитных полей, движение заряженных частиц в этих полях как распространение электромагнитных волн. Волновая оптика сделала понятными явление дифракции, механизм формирования изображения и игру факторов, определяющих разрешение, в световом микроскопе. Успехам в области теоретической и экспериментальной физики мы обязаны открытием электрона с его специфическими свойствами. Эти отдельные и, казалось бы, независимые пути развития привели к созданию основ электронной оптики, одним из важнейших приложений которой являлось изобретение ЭМ в 1930-х годах. Прямым намеком на такую возможность можно считать гипотезу о волновой природы электрона, выдвинутую в 1924 Луи де Бройлем и экспериментально подтвержденную в 1927 К.Дэвиссоном и Л.Джермером в США и Дж.Томсоном в Англии. Тем самым была подсказана аналогия, позволившая построить ЭМ по законам волновой оптики. Х.Буш обнаружил, что с помощью электрических и магнитных полей можно формировать электронные изображения. В первые два десятилетия 20 в. были созданы и необходимые технические предпосылки. Промышленные лаборатории, работавшие над электронно-лучевым осциллографом, дали вакуумную технику, стабильные источники высокого напряжения и тока, хорошие электронные эмиттеры.
В 1931 Р.Руденберг подал патентную заявку на просвечивающий электронный микроскоп, а в 1932 М.Кнолль и Э.Руска построили первый такой микроскоп, применив магнитные линзы для фокусировки электронов. Этот прибор был предшественником современного ОПЭМ. (Руска был вознагражден за свои труды тем, что стал лауреатом Нобелевской премии по физике за 1986.) В 1938 Руска и Б. фон Боррис построили прототип промышленного ОПЭМ для фирмы «Сименс-Хальске» в Германии; этот прибор в конце концов позволил достичь разрешения 100 нм. Несколькими годами позднее А.Пребус и Дж.Хиллер построили первый ОПЭМ высокого разрешения в Торонтском университете (Канада).
Широкие возможности ОПЭМ почти сразу же стали очевидны. Его промышленное производство было начато одновременно фирмой «Сименс-Хальске» в Германии и корпорацией RCA в США. В конце 1940-х годов такие приборы стали выпускать и другие компании.
РЭМ в его нынешней форме был изобретен в 1952 Чарльзом Отли. Правда, предварительные варианты такого устройства были построены Кноллем в Германии в 1930-х годах и Зворыкиным с сотрудниками в корпорации RCA в 1940-х годах, но лишь прибор Отли смог послужить основой для ряда технических усовершенствований, завершившихся внедрением в производство промышленного варианта РЭМ в середине 1960-х годов. Круг потребителей такого довольно простого в обращении прибора с объемным изображением и электронным выходным сигналом расширился с быстротой взрыва. В настоящее время насчитывается добрый десяток промышленных изготовителей РЭМ’ов на трех континентах и десятки тысяч таких приборов, используемых в лабораториях всего мира. В 1960-х годах разрабатывались сверхвысоковольтные микроскопы для исследования более толстых образцов. Лидером этого направления разработок был Г.Дюпуи во Франции, где в 1970 был введен в действие прибор с ускоряющим напряжением, равным 3,5 млн. вольт. РТМ был изобретен Г.Биннигом и Г.Рорером в 1979 в Цюрихе. Этот весьма простой по устройству прибор обеспечивает атомное разрешение поверхностей. За свою работу по созданию РТМ Бинниг и Рорер (одновременно с Руской) получили Нобелевскую премию по физике. См. также КРИСТАЛЛЫ И КРИСТАЛЛОГРАФИЯ; МОЛЕКУЛ СТРОЕНИЕ; НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ; ФИЗИКА ТВЕРДОГО ТЕЛА; ВИРУСЫ.